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PCR基因擴增實驗室建設(shè)
PCR基因擴增實驗室介紹和標(biāo)準(zhǔn)：
PCR實驗室又叫基因擴增實驗室。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達納米級別。
PCR實驗室必須建立嚴(yán)格的實驗室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確、確保實驗室衛(wèi)生安全，確保實驗室長期穩(wěn)定運行.
PCR設(shè)計規(guī)范 /PRINCIPLES
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配置原則 |
室全PCR線實驗(高檔實驗室) |
標(biāo)準(zhǔn)PCR實驗室（中檔實驗室） |
普通實驗室（普通實驗室） |
測序?qū)嶒炇遥▽？茖嶒炇遥?/span> |
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開展項目 |
涵蓋了目前分子生物學(xué)能開展所有項目，達到國內(nèi)甚至國際一流CR實驗室水平。 |
檢測項目齊全，涵蓋了目前臨床需求的常規(guī)檢測項目，達到國內(nèi)PCR標(biāo)準(zhǔn)實驗室的檢測水平。 |
臨床科室或小型醫(yī)院開展PCR項目，檢測項目滿足臨床需求，達到或達不到國內(nèi)PCR標(biāo)準(zhǔn)實驗室的標(biāo)準(zhǔn)。 |
開展測序的所有檢測項目，達到標(biāo)準(zhǔn)PCR實驗室水平 |
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項目先進性 |
除開展常規(guī)的檢測項目外，還需開展高端項目，如測序項目、超敏PCR項目、腫瘤檢測等高端項目。 |
開展項目技術(shù)性能基本滿足臨床需求，達到國內(nèi)PCR標(biāo)準(zhǔn)實驗室的檢測水平。 |
開展項目技術(shù)性只能滿足科室或小型醫(yī)院的當(dāng)前需求，不具有先進性。 |
國內(nèi)外最先進的PCR測序檢測項目，達到個體化診療的需求。 |
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人員要求 |
至少有兩人，除經(jīng)過普通PCR上崗培訓(xùn)外，要具有測序項目檢測實驗及結(jié)果分析能力。 |
至少有兩人，除經(jīng)過普通PCR上崗培訓(xùn)外，要具有測序項目檢測實驗及結(jié)果分析能力。 |
至少有兩人，除經(jīng)過普通PCR上崗培訓(xùn)外，要具有測序項目檢測實驗及結(jié)果分析能力。
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至少有兩人，除經(jīng)過普通PCR上崗培訓(xùn)外，要具有測序項目檢測實驗及結(jié)果分析能力。 |
PCR基因擴增實驗室技術(shù)參數(shù)：
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區(qū)域 |
壓力 |
溫度 |
相對濕度 |
照明 |
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PCR走廊 |
+5-0Pa |
20-26度
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40-60%RH |
主實驗室≥300LX，其余房間20-300LX |
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PCR試劑準(zhǔn)備區(qū) |
+10Pa |
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PCR樣品制備區(qū) |
+15Pa |
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PCR擴增及擴增產(chǎn)物分析區(qū) |
-15-250Pa |
基因擴增檢驗實驗室平面布局
1）臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設(shè)置原則
1、 試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)
2、 標(biāo)本制備區(qū)
3、 擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)
4、 擴增產(chǎn)物分析區(qū)（如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。）
2） 各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。
3） 進入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進行，即試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū) —>標(biāo)本制備區(qū)—>擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)—>擴增產(chǎn)物分析區(qū)。
4） 不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。
PCR擴增檢驗實驗室原則上分為三個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增和擴增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增和擴增產(chǎn)物分析區(qū)。各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行。
(1)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)
該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區(qū)應(yīng)對外界保持微正壓。
(2)標(biāo)本制備區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定DNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。
該區(qū)域主要進行的操作為DNA擴增和擴增片段的測定。此外，已制備的DNA模板(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。
PCR區(qū)完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。產(chǎn)物分析區(qū)如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。
(5)緩沖區(qū)與沖洗區(qū)
整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
可打開緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。外面有用于實驗后消毒，消毒區(qū)域有專用清洗液和專用潔凈洗手池，以及消毒紙巾。
若房間進深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。
各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。
PCR實驗室建設(shè)
1、主體結(jié)構(gòu)：
主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。
2、 標(biāo)準(zhǔn)的三區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：
將PCR過程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和PCR擴增、分析三個（或）四個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
可打開緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。
3、 消毒：
在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū) 還設(shè)置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。
4、 機械連鎖不銹鋼傳遞窗：
試劑和標(biāo)本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。
5、 地面
地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。
6、 照明
燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。
PCR實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實驗，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個實驗過程，若實驗工藝需要，還應(yīng)增加樣品粉碎過程。
一、分散形式PCR實驗室
所謂分散形式PCR實驗室，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實驗室，由于各個實驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。
二、組合形式PCR實驗室
所謂組合形式PCR實驗室,
是指完成PCR四個實驗過程的實驗用房相鄰布置，組成獨立實驗區(qū)域的形式。對于組合形式PCR實驗室，由于各個實驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染；核酸擴增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品。
如果使用熒光PCR儀，擴增室和產(chǎn)物分析室可以合并。
若房間進深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。
各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。
實驗室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內(nèi)壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求.。
PCR實驗室各區(qū)域管理規(guī)定：
試劑準(zhǔn)備區(qū)工作制度
一、實驗人員進入該區(qū)須更換工作服，穿本區(qū)專用綠色工作服， 戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。
二、實驗員在試劑準(zhǔn)備區(qū)接收標(biāo)本、準(zhǔn)備實驗用的試劑。
三、實驗員每天收齊標(biāo)本，驗收登記后，將標(biāo)本通過傳遞 窗送入標(biāo)本制備區(qū)。 四、在試劑準(zhǔn)備區(qū)配置好試劑后放入冰箱內(nèi)備用。需要時
通過傳遞窗送入標(biāo)本制備區(qū)。
五、每天的標(biāo)本及配置的試劑須登記記錄，應(yīng)書寫工整詳 細，使用本區(qū)專用的、帶有本室標(biāo)識的記錄本、紙和筆。
六、將本區(qū)廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專人將垃圾帶出 實驗室交醫(yī)院集中處理。
七、實驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。
標(biāo)本制備區(qū)工作制度
一、實驗人員進入該區(qū)須更換工作服，穿上本區(qū)專用藍色工作服， 戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。
二、把已準(zhǔn)備好的試劑放入冰箱試劑存放專區(qū)暫存。
三、記錄溫濕度計讀數(shù)、冰箱的溫度。
四、嚴(yán)格按照SOP文件及試劑盒要求進行實驗操作，加樣好的PCR 管須通過傳遞窗送入擴增及產(chǎn)物區(qū)。
五、使用本區(qū)專用的移液器及吸頭，使用過的離心管、吸頭須置于 盛有含氯消毒液的廢液缸中，實驗完畢后及時處理。將本區(qū)廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專人將垃圾帶出實驗室交醫(yī)院集中處理。
六、使用本區(qū)專用的帶有本區(qū)標(biāo)識的記錄本、紙和筆，其他區(qū)的用 品不得帶入本區(qū)。
七、實驗完畢關(guān)閉所有儀器，記錄儀器使用時間和運行狀態(tài)。
八、實驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。
擴增及產(chǎn)物分析區(qū)工作制度
一、實驗人員進入該區(qū)須更換工作服，穿上本區(qū)專用粉紅色 工作服，戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。
二、記錄溫濕度計讀數(shù)、冰箱的溫度。
三、本區(qū)主要進行目的基因的擴增及分析，須熟悉各擴增儀 的使用，擴增分析完后，記錄結(jié)果。
四、得到當(dāng)天室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果后，及時記錄在室內(nèi)質(zhì)控圖上并 進行分析。
五、試驗完畢后關(guān)掉擴增儀，記錄儀器使用時間和運行狀態(tài)。
六、每周由實驗室負責(zé)人對進行清潔維護并記錄。
七、擴增分析完后的反應(yīng)管，須裝入本室垃圾袋中，有專人 將垃圾帶出實驗室交醫(yī)院集中處理。
八、使用本區(qū)專用的帶有本區(qū)標(biāo)識的記錄本、紙和筆，其他區(qū)的用 品不得帶入本區(qū)。
九、實驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實驗臺面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。
PCR實驗室在操作時應(yīng)注意事項
PCR（基因擴增實驗室）檢測微量感染因子時，操作人員容易因為污染而導(dǎo)致各種問題。進行PCR操作時，操作人員一定要嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染事故的發(fā)生。
一、PCR實驗室劃分操作區(qū)：
目前，對于普通PCR，業(yè)內(nèi)還無法做到單人單管和實現(xiàn)完全封閉管理操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的物理區(qū)域內(nèi)進行，PCR的前處理和后處理一定要設(shè)計在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：
1、標(biāo)本處理區(qū)，包括： 擴增摸板制備;
2、PCR擴增區(qū)，包括： 反應(yīng)液的配制和PCR基因擴增;
3、產(chǎn)物分析區(qū)，包括：凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆制備。
各工作區(qū)要具有一定的隔離，操作器材要專用，而且要有一定方向性，如，標(biāo)本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→④產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材嚴(yán)禁拿到前后兩個工作區(qū)，避免交叉污染。
二、PCR實驗室試劑分裝要求：
PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的負壓工作臺或超凈工作臺進行配制和分裝，所有的吸頭和加樣器都需固定放于其中，吸頭不能用來吸取擴增后的DNA和其它來源DNA：
1、PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水;
2、引物和d-NTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制;
3、引物和d-NTP應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標(biāo)明分裝時間，以備發(fā)生污染時及時查找原因和追溯污染源頭;
三、PCR擴增重要標(biāo)準(zhǔn)
1、PCR實驗靈敏度
PCR實驗靈敏度：是指PCR擴增反應(yīng)能夠檢測到目的基因的最小值。研究結(jié)果表明，影響PCR擴增效率的因素，有模板的完整性、反應(yīng)溫度、復(fù)雜程度、引物純度及其與模板結(jié)合效率、DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性與擴增性能、反應(yīng)緩沖液的離子組成(主要指： 陽離子)、反應(yīng)優(yōu)化劑等，這些因素都顯著影響
PCR實驗檢測靈敏度。在最佳擴增條件下，常規(guī)PCR反應(yīng)能夠檢測到pg(10～12g)數(shù)量級目的基因。對于一個特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應(yīng)體系(包括DNA聚合酶與反應(yīng)緩沖液等)就是研究者提高PCR實驗靈敏度的關(guān)鍵因素了。
2、PCR實驗特異性
PCR實驗特異性：是指在PCR擴增過程中，專一性擴增目的片段而非其他
片段的性能。
在PCR實驗本身的靈敏度很高，且實驗條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會在目的片段出現(xiàn)同時伴隨有其它雜帶，即發(fā)生非特異性擴增現(xiàn)象。模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應(yīng)條件控制等均會影響PCR擴增特異性。近年來的研究結(jié)果表明，緩沖液品質(zhì)(如反應(yīng)優(yōu)化劑、離子種類與組成等)對保證PCR特異性擴增起著重要作用。
3、PCR靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)
PCR實驗靈敏度與特異性是一對此長彼消特性，這也決定我們實驗體系調(diào)節(jié)實際上就是需要找到適合實驗靈敏度與特異性的平衡點。由于PCR體系中的成分眾多，使得組合較多，篩選工作也就相對繁雜。四、PCR實驗操作注意事項：
盡管PCR擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)導(dǎo)致的，但樣品間的交叉污染也是常見原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)時要謹(jǐn)慎對待，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)謹(jǐn)慎操作，一般需做到以下幾點：
1、戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，應(yīng)立即更換手套;
2、避免反應(yīng)液飛濺，若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;
3、使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免空氣中氣溶膠的污染;
4、操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后再分裝，這樣既可以減少操作次數(shù)，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；
5、最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管;
6、操作時設(shè)立空白對照和陰陽性對照，既可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可
以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性;
7、由于實際操作時加樣器很容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，所以操作者最好使用高壓處理過的或可替換的加樣器。 假如沒有這種特殊的加樣器，至少在PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，嚴(yán)禁交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個相鄰區(qū)域使用;
8、重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。
五、綜述：
由于PCR實驗操作非常專業(yè)，在設(shè)計PCR基因擴增實驗室時設(shè)計師也要充分考慮上述技術(shù)要求，避免PCR實驗室在后續(xù)使用時出現(xiàn)返工、返修問題。
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